一、滿足抗體選擇的基本條件
靶蛋白特異性：確定目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或者胞內(nèi)標(biāo)記，知道您要檢測(cè)什么。
種屬：嚴(yán)格按照待測(cè)樣本種屬選擇抗體來(lái)源，流式抗體基本無(wú)法進(jìn)行種屬間交叉反應(yīng)。
應(yīng)用領(lǐng)域：可用于流式實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明書(shū)中明確標(biāo)注經(jīng)FC實(shí)驗(yàn)測(cè)試，有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖和用量說(shuō)明;
抗體克隆號(hào)：一般選擇參考文獻(xiàn)上提到的克隆;同一抗體多個(gè)克隆號(hào)的情況下，可以選擇熒光標(biāo)記種類(lèi)zui多的那個(gè)克隆。
二、確定流式細(xì)胞儀的參數(shù)配置
在設(shè)計(jì)流式方案前，根據(jù)可能需要同時(shí)檢測(cè)指標(biāo)的多少數(shù)量，先確定需要在哪臺(tái)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的型號(hào)，對(duì)該儀器的參數(shù)配置，要了解以下幾個(gè)方面信息：
激光器：常見(jiàn)的流式細(xì)胞儀有488nm和635nm633nm兩個(gè)激光器，但有些機(jī)器在購(gòu)買(mǎi)時(shí)因某些原因，只裝了一個(gè)488nm激光器，所以需要注意型號(hào)相同的機(jī)器也未必激光配置相同。
濾光片：也就是有幾個(gè)檢測(cè)通道，這決定了你zui多可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)。
儀器的具體型號(hào)：有助于再次確定檢測(cè)通道。因?yàn)橥粋€(gè)熒光在不同的流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，有時(shí)候檢測(cè)通道也是不一樣的。
三、流式抗體使用劑量
同一個(gè)產(chǎn)品通常會(huì)提供多個(gè)規(guī)格供您選購(gòu)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體樣本量和說(shuō)明書(shū)建議用量來(lái)確定抗體用量：
細(xì)胞數(shù)：通常情況下流式檢測(cè)一次的樣本量為106~108個(gè)細(xì)胞，建議對(duì)樣本做細(xì)胞計(jì)數(shù)，以保證抗體標(biāo)記效果*;
Test包裝：以test為計(jì)量單位的抗體，按照每test細(xì)胞懸液體積計(jì)算出每次加入多少u(mài)l抗體即可;Ug包裝：以u(píng)g為計(jì)量單位的抗體，需要根據(jù)說(shuō)明書(shū)每次抗體加入多少u(mài)g先算出能使用的次數(shù)，再通過(guò)總體積算出每次加入多少u(mài)l抗體。
四、同型對(duì)照抗體的選擇
同型對(duì)照(Isotype Control)，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，是真正意義上的流式陰性對(duì)照，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)*的一項(xiàng)。
來(lái)源：同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標(biāo)記的免疫球蛋白，也要求使用相同劑量。同型對(duì)照一定要選擇準(zhǔn)確，通常在熒光一抗的說(shuō)明書(shū)中，廠家會(huì)給出同型對(duì)照抗體的貨號(hào);
純化級(jí)別抗體：如果是純化的一抗加熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體(如樣品管為：純化的CD3+PE標(biāo)記的二抗+樣本;則對(duì)照管為：純化的同型對(duì)照+ PE標(biāo)記的二抗+樣本);
五、熒光的選擇建議
直標(biāo)還是間標(biāo)(Biotin)：待測(cè)抗原表達(dá)高的盡量選擇直標(biāo)抗體，待測(cè)抗原表達(dá)豐度低的要考慮選間生物素標(biāo)記標(biāo)抗體。
熒光強(qiáng)弱：熒光本身有強(qiáng)弱之分，可視抗原表達(dá)強(qiáng)弱及分群情況選擇合適的熒光。如抗原表達(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光例如：PE、APC;反之，抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇zui常用的弱熒光例如FITC即可(常用熒光強(qiáng)弱排序程度為：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC)，具體熒光信息請(qǐng)參考熒光染料信息。
類(lèi)似熒光的權(quán)衡：可以嘗試選擇新型熒光Alexa Fluor、eFluor等。因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對(duì)激光穩(wěn)定性好，對(duì)PH 值不敏感，具有水溶性。
六、多色熒光搭配的原則
多色分析方案中熒光抗體的選擇和搭配，會(huì)受到很多因素的制約，是一個(gè)難點(diǎn)：
檢測(cè)通道不能沖突：每個(gè)檢測(cè)通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配(如FL1選擇了FITC標(biāo)記的抗體，就不能再選擇Alexa Fluor488標(biāo)記的抗體;而同組實(shí)驗(yàn)的其余抗體選擇PE或者APC標(biāo)記，都是可以隨意組合的);
熒光強(qiáng)弱：所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會(huì)導(dǎo)致較大的補(bǔ)償。例如，PE-Ccy5與APC同時(shí)標(biāo)記，將會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)償過(guò)度，需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。zui常用的4色熒光搭配是：FITC、PE、PercpPerCP-Ccy5.5、APC;
多色熒光搭配：多色分析往往會(huì)因個(gè)別抗體熒光素種類(lèi)極少而受到限制，需要同時(shí)參考多家抗體公司的產(chǎn)品進(jìn)行方案設(shè)計(jì)。
流式抗體的使用事項(xiàng)
1.建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過(guò)量或抗體過(guò)量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響，因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件。注：不同的流式技術(shù)對(duì)抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量，抗體用量為10μl，而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個(gè)細(xì)胞，抗體用量減少到5μl。
2.直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存，不要冷凍。盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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