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　　【復(fù)蘇】

　　1.將配置好的*培養(yǎng)基放入37℃水浴中預(yù)熱5-15 min;

　　2.從液氮中取出干細(xì)胞迅速放入37℃水浴快速解凍(解凍后不要繼續(xù)孵育細(xì)胞);

　　3.在超凈臺(tái)中加入5 ml的 *培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000 rpm離心5 min;

　　4.棄上清，加入 5 ml的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到T-25培養(yǎng)瓶中(帶濾芯);

　　5.將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2 的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

　　6.第二天用新鮮的 *培養(yǎng)基給細(xì)胞換液。

　　間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基【 培養(yǎng)】

　　1.在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，即可傳代;

　　2.37℃水浴預(yù)熱*培養(yǎng)基;

　　3.在超凈臺(tái)中，棄掉T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞;

　　4.在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，有細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，即可加入5 ml *培養(yǎng)基終止消化;

　　5.用移液器輕輕吹打瓶壁上剩余的細(xì)胞，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散;

　　6.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，1000 rpm離心5 min;

　　7.棄上清,加入15-20 ml的 *培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中或按適當(dāng)比例傳到T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。確保后融合度在25-50%之間，細(xì)胞密度在1×104cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶)，混合細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布;

　　8.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2 的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

　　9.每?jī)商煊眯迈r、預(yù)熱的*培養(yǎng)基進(jìn)行換液。

　　間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基【凍存】

　　1.細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，用胰酶對(duì)待凍存的細(xì)胞進(jìn)行消化，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　2.1000 rpm離心5 min，去掉上清。

　　3.根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況，加入適量的凍存液，使細(xì)胞密度在1×106/ml左右(或根據(jù)自己希望達(dá)到的細(xì)胞密度)。

　　4.輕輕地重懸細(xì)胞(務(wù)必重懸均勻)，將重懸的細(xì)胞按等份加入到滅菌的凍存管(需提前做好標(biāo)記或者貼上標(biāo)簽)中，旋緊凍存管蓋。

　　5.將凍存管放入程序降溫凍存盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃。

　　6.第二天將細(xì)胞從-80℃轉(zhuǎn)移到液氮中。